Lowenstein-Jensenovo médium se používá k izolaci původce tuberkulózy a stanovení citlivosti na antituberkulotika.
Prostředí objednávky Zeptejte se
Lowenstein-Jensenovo médium (LJ medium) je selektivní médium, které se běžně používá pro kultivaci a izolaci mykobakterie, zejména Mycobacterium tuberculosis, z klinických vzorků. Prostředí LJ bylo původně vyvinuto Lowenstein. kteří zahrnovali konžskou červeň a malachitovou zelenou k potlačení nežádoucích bakterií. Předkládaná kompozice zahrnuje glycerované médium na bázi vajec a je založena na Jensenově modifikaci. Jensen upravil Lowensteinovo médium změnou obsahu citrátu a fosfátu, odstraněním barviva Kongo červeň a zvýšením koncentrace malachitové zeleně. Gruft dále modifikoval LJ médium přidáním penicilinu, kyseliny nalidixové a ribonukleové kyseliny (RNA) pro zlepšení selektivity. Toto prostředí podporuje růst mnoha mykobakterie, a může být také použit k testování niacinu.
Složení Lowenstein Jensen (LJ)
Složení
Číslo
Princip Lowenstein Jensen (LJ) Media
L-asparagin a bramborová mouka jsou zdrojem dusíku a vitamínů. Fosforečnan draselný a síran hořečnatý podporují růst těla a působí jako pufry. Malachitová zeleň zabraňuje růstu většiny kontaminantů zbývajících po dekontaminaci vzorku a zároveň podporuje růst mykobakterií. Vaječná suspenze obsahuje mastné kyseliny a bílkoviny nezbytné pro metabolismus mykobakterií. Při zahřívání se vaječný albumin sráží a poskytuje pevný povrch pro očkování. Glycerol slouží jako zdroj uhlíku a je příznivý pro růst lidských tuberkulových bacilů, ale nepříznivý pro hovězí typ.
Vaječná emulze, L-asparagin a bramborový škrob, bohaté na nutriční prvky, obsažené v hotové živné půdě Lowenstein-Jensen, vytvářejí ideální podmínky pro kultivaci mycobacterium tuberculosis. Glycerin a slepičí vejce jsou bohatým zdrojem mastných kyselin a bílkovin, které podporují mikrobiální metabolismus. Malachitová zeleň funguje jako indikátor kyselosti a je také inhibitorem růstu. Výskyt modře zbarvených zón na povrchu živného média ukazuje na zvýšení kyselosti v důsledku růstu grampozitivních bakterií. Růst gramnegativních bakterií je doprovázen výskytem žlutých zón.
V metodě Graft zabraňují penicilin a kyselina nalidixová spolu s malachitovou zelení růstu většiny kontaminantů, které přežijí dezinfekci vzorku, a zároveň podporují rychlý růst mykobakterií. RNA působí jako stimulant a pomáhá zvýšit rychlost vylučování mykobakterií.
Použití Lowenstein Jensen (LJ)
- Používá se k diagnostice mykobakteriálních infekcí.
- Používá se k testování citlivosti izolátů na antibiotika.
- Používá se také k rozlišení různých typů mykobakterií (na základě morfologie kolonií, rychlosti růstu, biochemických charakteristik a mikroskopie).
Omezení Lowenstein Jensen (LJ) Media
- Pro úplnou identifikaci se doporučuje provést biochemické a/nebo sérologické testy na koloniích z čisté kultury.
- LJ médium vyžaduje inkubaci v atmosféře 5-10% CO2 k izolaci mykobakterií. Z neznámých důvodů je obtížné odstranit mykobakterie z nádob na zhášení svíček.
- Negativní výsledky kultivace nevylučují aktivní mykobakteriální infekci.
- Kvůli rozdílům ve výživě můžete najít některé kmeny, které nerostou dobře nebo nemohou růst na tomto médiu. Pro potvrzení dostupnosti Mycobacterium spp. Jsou potřeba další testy.
- Média by měla být chráněna před všemi zdroji světla, protože malachitová zeleň je velmi citlivá na světlo.
Objednejte ve středu
Vytvořte si na webu přihlášku, co nejdříve vás budeme kontaktovat a zodpovíme všechny vaše dotazy.
Číslo publikace RU2233876C2 RU2233876C2 RU2002113140/13A RU2002113140A RU2233876C2 RU 2233876 C2 RU2233876 C2 RU 2233876 2RU2002113140 13/2002113140 A RU 13/2002113140A RU 13 A RU2002113140 A RU 2002113140A RU 2002113140 C2233876 RU2 C2233876 RUC Klíčová slova autority 2 C2233876 RUC2 Prior mycobacteria geotermální voda médium růst živné médium Datum předchozího 2002-05-18 Číslo přihlášky RU2002113140/13A Jiné jazyky Anglicky ( en ) Jiné verze RU2002113140A ( ru Vynálezce R.A. Nuratinov (RU) R.A. Nuratinov. R.A. Nuratinov. Eva (RU) E.A. Verdieva F.I. Islamova (RU) F.I. Islamova Původní pověřenec Caspian Zonal Research Veterinary Institute Datum priority (Datum priority je, že společnost Google neprovedla právní analýzu a neposkytuje žádné prohlášení ohledně přesnosti uvedeného data.) 2002- 05-18 Datum podání 2002-05-18 Datum zveřejnění 2004-08-10 2002- 05-18 Přihláška podaná Caspian Zonal Research Veterinary Institute Podaná Critical Caspian Zonal Research Veterinary Institute 2002-05-18 Prioritní patent Cri2002113140 RU13 priorita 2233876RU2 Cri /RU2004C01/ru 10-2002113140-2002113140 Zveřejnění publikace RU2004A Kritický patent /RU08A/ru 10-2004-08 Udělena přihláška Kritická publikace 10-2233876-2 Zveřejnění 2233876ru2RU CrXNUMXRUXNUMXRU
Abstraktní
Vynález se týká biotechnologie, medicíny a veterinární medicíny, zejména bakteriologie tuberkulózy u lidí a zvířat. Živné médium pro izolaci a pěstování mykobakterií navíc obsahuje glykol, jako zdroj minerálních solí – geotermální vodu o salinitě 5,02 g/l a bramborový extrakt připravený s geotermální vodou. Geotermální voda má příznivý vliv na růst a množení mykobakterií, protože obsahuje značnou škálu aniontů a kationtů, humusové a bitumenové látky. Vynález umožňuje zvýšit rychlost růstu a rychlost výsevu mykobakterií jak z laboratorních kmenů, tak ze vzorků biomateriálů. 3 stoly
Popis
Vynález se týká veterinární medicíny a lékařství, zejména pro výsev patologického materiálu a pěstování mykobakterií při diagnostice tuberkulózy u lidí a zvířat.
Mycobacterium tuberculosis (zejména první generace) vyžaduje pro růst a rozmnožování růstové látky, což se vysvětluje jejich nedostatečnou produkcí bakteriemi. Proto je na pevných živných půdách obsahujících frakce vaječného žloutku, asparaginu nebo glykolu pozorován výrazně lepší růst než na médiích, která tyto složky neobsahují [1].
V současné době jsou v praxi veterinárních a lékařských laboratoří pro bakteriologickou diagnostiku tuberkulózy nejrozšířenějšími pevnými živnými médii Lowenstein-Jensen, Finn II, Gelberg, Mordovsky („Novaya“), média 6 a 9 V.A. Anikina atd. Je třeba poznamenat, že neexistuje univerzální, snadno vyrobitelné živné médium pro pěstování mykobakterií, a proto se pro zvýšení efektivity bakteriologického výzkumu biomateriálů používají 2-3 různá média.
Uvedená média se od sebe jen málo liší chemickým složením a fyzikálními vlastnostmi a sestávají ze soli a žloutků slepičích vajec. Proto se rychlost výsevu a rychlost růstu mykobakterií na různých médiích mírně liší v jednom nebo druhém směru.
Na známém hustém médiu Levenstein-Jensen vajíček rostou mykobakterie velmi pomalu, viditelný růst se objevuje po 4-10 týdnech inkubace v termostatu a neumožňuje získat dostatečné množství biomasy potřebné k identifikaci. Kromě toho jsou přísady, které tvoří toto médium, vzácné, a proto drahé [2].
Nevýhody suchého živného média „Novaya“ (Mordovsky) zahrnují špatnou rozpustnost suché žloutkové hmoty a nedostatečnou hustotu připraveného média po koagulaci. Navíc při skladování v chladničce nebo při delší kontrole teploty médium rychle vysychá, a proto se růst mykobakterií opozdí nebo se úplně zastaví [3].
Nejblíže nárokovanému médiu je Gelbergovo husté vaječné médium, protože obsahuje složky (glycerin, slepičí vejce, malachitová zeleň, bramborový vývar), které jsou součástí navrhovaného média. Gelbergovo médium však navíc obsahuje solné složení (fosforečnan draselný, citrát sodný, síran hořečnatý), což jej výrazně odlišuje od navrženého média.
Složení prostředí prototypu je následující:
Disubstituovaný fosforečnan draselný, g 1,0
Citran sodný, g 1,0
Síran hořečnatý, g 1,0
Pepton, g 6,0
Glycerin, ml 30,0
Mléko, ml 100,0
Bramborový vývar, ml 100,0
Slepičí vejce, ks. 6,0
Kuřecí vaječné žloutky, ks. 4,0
Destilovaná voda, ml 1000,0
Nevýhodou tohoto média je nízká inokulovatelnost vzorků biomateriálu ze zvířat i lidského sputa, nízká rychlost růstu mykobakterií, navíc médium obsahuje 3 minerální soli, což dle našeho názoru dostatečně nezajišťuje kvalitativní potřeby mykobakterií. pro makro- a mikroprvky důležité pro život. Výroba média je komplikována předběžnou přípravou solného roztoku (vážení, rozpouštění, autoklávování, míchání s vaječnou kompozicí atd.), což je spojeno s dalšími náklady na materiál a práci.
Účelem vynálezu je zvýšit účinnost bakteriologické diagnostiky tuberkulózy optimalizací podmínek pro růst mykobakterií na médiu s upraveným chemickým složením.
Tohoto cíle je dosaženo tím, že Gelbergovo médium obsahující glycerin, slepičí vejce, žloutky, malachitovou zeleň, solný roztok připravený na bázi destilované vody je připraveno na bázi geotermální vody jako zdroje minerálních solí, která nahrazuje 87,5 % přidané destilované vody. Dále se přidává bramborový extrakt připravený z geotermální vody.
Navrhované prostředí má následující složení:
Glykokol, g 1,5
Glycerin, ml 3,0
Geotermální voda, ml 56,25
Slepičí vejce, ks. 6
Bramborový extrakt na bázi geotermální vody, ml 75,0
2% roztok malachitové zeleně, ml 5,0
Destilovaná voda, ml 18,75
Srovnávací analýza s prototypem umožňuje dospět k závěru, že navržené složení média se od známého liší s výjimkou složení solí, nahrazením destilované vody geotermální vodou a přidáním bramborového extraktu připraveného na základě stejná voda. Navržené technické řešení tedy splňuje kritérium „novosti“.
Analýza geotermální vody pomocí fotometrie, komplexometrie, potenciometrie, kapilární luminiscence, atomové absorpce a plamenové emisní spektrometrie ukázala, že se liší od vodovodní a destilované vody ve výrazně větší rozmanitosti a kvantitativním obsahu NH aniontů.4, Na, K, Mg, Ca, Sr, Fe, Mn, Zn, Cu a Ni, jejichž celková hodnota byla 1,6771 g/l; kationty Fe, Cl, Br, J, SO4, NSO3,HPO4, NE3 – celkem 3,4732 g/l. Geotermální voda navíc obsahuje neutrální a kyselé bitumeny (2,5 mg/l), huminové látky (7,1 mg/l), které obohacují prostředí o různé organické substráty a růstové látky. Komplex mikro- a makroprvků obsažený v geotermální vodě měl příznivější vliv na růst a množení mykobakterií než přídavek pěti minerálních solí v rámci média Finn II.
Při experimentálním testování byly testovány 4 varianty prostředí, které se lišily kvantitativním obsahem přiváděné geotermální vody místo destilované vody. Recepty na jejich přípravu jsou uvedeny v tabulce 1.
Jak je patrné z tabulky 1, do variant navrhovaného média byla místo destilované vody přidávána geotermální voda v různých objemech (od 25 do 100 %) a bramborový extrakt byl připraven pouze s geotermální vodou. K těmto možnostem média nebyly přidány minerální soli. Celkový obsah geotermální vody se v různých variantách pohyboval od 62,5 do 100 %.
K přípravě média bylo 6 slepičích vajec nalito do sterilní baňky s kuličkami, po přidání každého vejce protřepáno, dokud nevznikla homogenní hmota, a bylo přidáno 5 ml 2% malachitové zeleně, 1,5 g glykolu a 3 ml glycerolu. . Odpovídající množství (18,75; 37,5; 56,25; 75,0 ml) geotermální vody bylo přidáno do každé možnosti média a chybějící množství destilované vody bylo přidáno do 75 ml (v tomto pořadí: 56,25; 37,5; 18,75; 0 ml) a poté 75 bylo přidáno ml bramborového extraktu připraveného na bázi geotermální vody. Média byla nalita do zkumavek a udržována ve srážecím zařízení v nakloněné poloze při teplotě 85 °C po dobu 45 minut. Připravené série médií byly inokulovány mykobakteriemi různých typů laboratorních kmenů M.bovis a M.avium současně ze stejného ředění bacmass. Jako kontrolní média posloužily Levenshtein-Jensen a Finn II, které byly připraveny podle návodu autorů. Pozorování plodin byla prováděna až do úplného hojného nahromadění bakmasy. Současně bylo zaznamenáváno načasování primárního výskytu kolonií a růstový vzorec, byly studovány kulturní a morfologické vlastnosti kolonií a denní kontrolou plodin byl sledován stupeň akumulace bakterií. Pro srovnávací test modifikovaného média byla provedena série paralelních inokulací M. bovis a M. avium na 10 zkumavkách každé varianty a na kontrolní médium Finn II. Plodiny byly prováděny podle standardních metod. Výsledky výzkumu jsou uvedeny v tabulce 2.
Při každodenním zkoumání plodin se ukázalo, že k výskytu primárních kolonií na médiích různých variant dochází téměř současně (4. den M.avium a 6. den M.bovis), nicméně počet zkumavek s růstem a abundance bacmass na první, druhé a třetí možnosti se významně lišily od kontroly. Nejlepší růst M.avium byl zjištěn u třetí varianty a M.bovis u první a třetí varianty média. Kolonie mykobakterií na nich se vyznačovaly mohutností bakteriální hmoty vyčnívající nad povrch média, která tvořila „svazky“. M.avium roste v souvislém trávníku, viditelný pouhým okem 4 dny po výsevu. Barva kolonií a morfologické vlastnosti plodin se nezměnily.
Vzorky sputa odebrané lidem s tuberkulózou byly naočkovány na testovací médium. Výsledky těchto studií jsou uvedeny v tabulce 3.
Jak je patrné z tabulky 3, primární růst mykobakterií na třetí variantě média byl detekován 13. den po výsevu, zatímco u všech ostatních variant – 16. den, na médiu Finn II – 16. den, a na Levenshteinově médiu – 17. den Jensen – 20. den. Současně bylo 6. den po inokulaci izolováno 4 kultur na médium první a třetí možnosti, 4 na médium Finn II a 27 na médium Lowenstein-Jensen Počet izolovaných kultur 5 dní po inokulaci vzorky sputa odpovídaly: první možnost – 50 (3 %); druhý – 30,0 (6 %); třetí – 60,0 (3 %); čtvrtý – 30,0 (4 %); Finn II – 40,0 (4 %) a Lowenstein-Jensen – 40,0 (XNUMX %).
Růst M. tuberculosis na médiích první a třetí varianty se lišil nejen počtem růstových trubic, ale i povahou kolonií. Jak velikost, tak počet kolonií na těchto variantách byly významně vyšší než u jiných variant a kontrolních médií. Akumulace bacmass se objevila v krátkém časovém období.
Studie tedy prokázaly, že médium připravené na bázi geotermální vody bez přídavku jakýchkoli minerálních solí vede ke zrychlenému růstu, což odpovídá rychlé akumulaci hojných mykobakterií, zvýšení frekvence jejich izolace ze vzorků sputa, které v konečném důsledku vykazuje výrazně vyšší efektivitu využití navrženého prostředí. Spolu s tím se snižují materiálové náklady (ekonomická efektivita) a mzdové náklady spojené s přípravou solné kompozice a zjednodušuje se proces výroby média, které je přístupné jakékoli bakteriologické laboratoři.
Výzkum ukázal, že pro praktické použití je velmi výhodná třetí možnost, protože rychlost a mohutnost růstu laboratorních kmenů i mykobakterií izolovaných z biomateriálu na něm se příznivě lišila od ostatních možností a kontrolních médií.
Zdroje informací
1. Vasilev V.N. Mykobakterióza a mykózy plic. Medicína a tělesná výchova. – Sofie, 1971, – 382 s.
2. Drabkina P.O. Mikrobiologie tuberkulózy. – M.: Medgiz, 1963. – S. 94-99.
3. Chichibabin E.S. Testování živného média „New“ (Mordovský) v praktických podmínkách bakteriologické laboratoře // Problematika tuberkulózy. – 1983. – č. 1. – S. 67-68.
Nároky (1)
Živné médium pro izolaci a pěstování mykobakterií, obsahující zdroj minerálních solí připravený v destilované vodě, slepičí vejce, glycerin, malachitovou zeleň 2 %, zdroj živin na bramborové bázi, vyznačující se tím, že navíc obsahuje glykol jako zdroj minerálních solí – geotermální voda a jako zdroj živin na bázi brambor – bramborový extrakt připravený s geotermální vodou, s následujícím množstvím přísad:
