Ruští vědci navrhli novou neinvazivní metodu pro studium oběhového systému zebřiček. Osvětlením svého těla vlnami světla v infračervené oblasti mohli autoři pozorovat tlukot srdce, umístění krevních cév a průtok krve nejen v nejranějších fázích vývoje, kdy jsou larvy vizuálně průhledné, ale také ve velmi pozdějších fázích, kdy studovaní jedinci prakticky nepropouštějí viditelné světlo. Navrhovaný přístup pomůže podrobněji studovat účinek léků, environmentálních a dalších faktorů na fungování kardiovaskulárního systému a také studovat procesy vývoje jeho patologií. Výsledky studie podpořené grantem Ruské vědecké nadace (RSF) byly zveřejněny v časopise Scientific Reports.
Zebrafish jsou jedním z nejoblíbenějších modelových objektů mezi biology. Tato zvířata jsou nenáročná na údržbu, rychle rostou a mají také oběhový systém podobnou strukturou jako lidská embrya. Srdeční onemocnění a patologické stavy kardiovaskulárního systému jsou proto často studovány na příkladu zebrafish. Takové studie se často provádějí pomocí optických metod, které nepoškozují zvířata: průhledné tělo ryby je osvětleno viditelným a blízkým infračerveným zářením. Intenzita procházejícího světla v přítomnosti průtoku krve závisí na srdečním rytmu a pozorováním změn mohou vědci detekovat struktury obsahující krev, mapovat krevní cévy, měřit srdeční rytmy a řešit mnoho dalších problémů souvisejících s analýzou struktury kardiovaskulárního systému. . Takové optické přístupy však fungují dobře, pokud jsou ryby malé a průhledné. S přibývajícím věkem – již ve věku jednoho týdne – získávají barvu, která zabraňuje pronikání viditelného záření tkání. Vědci proto hledají přístupy, které jim umožní studovat strukturu a fungování kardiovaskulárního systému ryb, i když jejich těla již nejsou průhledná. Vědci z Vědeckého a technologického centra pro unikátní přístrojové vybavení Ruské akademie věd (Moskva), Národní výzkumná univerzita ITMO (Petrohrad), Moskevská státní technická univerzita pojmenovaná po N. E. Baumanovi (Moskva), Moskevská státní univerzita pojmenovaná po M. V. Lomonosovovi ( Moskva) a Institut biologie vnitrozemských vod pojmenovaný po I.D. Papanin RAS (Borok) navrhl použít elektromagnetické záření o delším rozsahu vlnových délek ke studiu kardiovaskulárního systému než u standardních optických metod. Experimenty obvykle využívají viditelné a blízké infračervené světlo s vlnovými délkami od 400 do 1000 nanometrů, což je výhodné z hlediska vizuálního pozorování a záznamu konvenčními videokamerami.
Pro pokrytí širšího spektra autoři nainstalovali do mikroskopu dva typy detektorů záření – první pracoval v rozsahu 400-1000 nanometrů a druhý – 900-1700 nanometrů. Vědci poté porovnali dva režimy sledováním kardiovaskulárního systému velkého počtu dospělých zebřiček. Experimenty ukázaly, že oba přístupy mohou monitorovat dynamiku srdečního tepu ryb, což umožňuje jejich použití při studiu poruch srdečního rytmu. Pomocí prvního kratšího rozsahu vlnových délek (400–1000 nanometrů) však není možné zkoumat rybí cévy přes pigmentované oblasti kůže, ani určit rychlost proudění krve v těchto místech. Záznamem a analýzou záření o delších vlnových délkách naopak vědci získali detailní snímky i těch nejmenších plavidel. To je vysvětleno skutečností, že barva kůže se ukazuje jako „transparentní“ pro vlnové délky v rozsahu 900–1700 nanometrů.
„Přístupy, které navrhujeme, otevírají možnost studovat vývoj a patologické stavy kardiovaskulárního systému u starších zebřiček, aniž by to způsobilo újmu samotným zvířatům. Dlouhodobé experimenty na těchto modelových objektech jsou důležité pro vývoj nových přístupů k diagnostice a léčbě patologií oběhového systému. Budeme pokračovat ve zdokonalování optických metod, rozšiřování možností neinvazivní diagnostiky různých tkání a vnitřních orgánů,“ říká Demid Khokhlov, mladší vědecký pracovník Laboratoře akusticko-optické spektroskopie Vědeckotechnického centra pro výrobu unikátních přístrojů v Rusku. Akademie věd.
Akvarijní rybka zebřička je již dlouho předmětem vývojové biologie. V posledních letech je však začali používat neurovědci, širší fyziologové a výzkumníci rakoviny.
Foto: flickr.com / Tohru Murakami
První GM mazlíčci
Rybičky s latinským názvem Danio rerio, typické pro jihoasijské řeky, patří do čeledi kaprovitých. Zebřička má na těle tmavé a světlé pruhy, pravděpodobně proto ji anglicky mluvící nazývají zebrafish. Danios jsou nenároční na chov a hodně se pohybují, proto je akvaristé milují.
Danios mohou být nejen pruhované, ale také růžové, zlaté a skvrnité. Tyto formy byly vyvinuty „konvenčním“ výběrem. A jsou ryby, které fluoreskují. Pomocí metod genetického inženýrství jim byl přidán jeden nebo dva geny – buď GFP (zelený fluorescenční protein) z medúzy, nebo RFP (červený fluorescenční protein) z korálů, nebo oba. V prvním případě zebrafish svítí zeleně, ve druhém – červeně a pokud jsou přítomny oba geny – žlutě. Patentovaný název pro tyto svítící ryby je GloFish a na trh ve Spojených státech byly uvedeny v roce 2003. Je škoda, že nyní je v mnoha zemích světa jejich dovoz a údržba zakázána kvůli strachu z geneticky modifikovaných předmětů. A přesto to byl GloFish, který se stal prvním GM mazlíčkem.
Transparentní benefity
Zpočátku byli Danio rerio nepostradatelní ve výzkumu vývojové biologie. Za prvé, rybí embrya se nevyvíjejí v těle matky nebo ve vejci s hustou skořápkou, ale ve vejci, což usnadňuje manipulaci a pozorování. Za druhé, potěr zebrafish je téměř průhledný, což je opět vhodné pro experiment. Konečně se rychle vyvíjejí: od tření do vylíhnutí z vajíček uplynou pouhé čtyři dny. Není třeba čekat tři týdny jako u kuřete a není třeba otevírat vejce.
Ano, rybí embryogeneze se liší více od lidské embryogeneze než od ptačí embryogeneze, ale míra detailu v případě zebřičky je vyšší a existuje více příležitostí pro experimentální manipulace. Vývojoví biologové po desetiletí manipulovali s geny rybích embryí a identifikovali změny, ke kterým taková manipulace povede. Díky tomu je vývoj zebřičky načasován a byly identifikovány stovky faktorů, které ovlivňují přeměnu oplodněného vajíčka v rybičku. Mnoho genů zapojených do embryogeneze zebrafish našlo shody v lidském genomu (homologické geny u různých druhů, které plní stejnou funkci, se obvykle nazývají ortologové), což znamená, že můžeme předpokládat, že ovlivňují i náš nitroděložní vývoj.
Laboratorní myši se samozřejmě používají i ve výzkumech vývojové biologie, ale mají velkou nevýhodu: myši jsou neprůhledné. Nyní existují technologie, které to řeší. Ale za prvé, po jejich použití embrya nezůstanou naživu, a za druhé, nejsou vhodná pro všechny tkáně. Alespoň pokud jde o CLARITY, techniku využívající akrylamidové hydrogely používané k fixaci mozkové tkáně. Mimochodem, k dosažení požadovaného výsledku je třeba lék fixovat několik týdnů. A kromě toho, ačkoli se myši množí velmi rychle, zebřičky jsou v tomto parametru před nimi. Samice této ryby dokáže každý týden naklást stovky vajíček.
Ryby, rakovina a medicína
Nejen potěr Danio rerio je užitečný pro vědu. Mnoho cenných informací přinášejí i dospělé ryby.
Genom zebrafish byl sekvenován a porovnán s lidským genomem (Nature, 496, 498–503, 2013, doi:10.1038/nature12111, celý text). Ukázalo se, že asi 70 % lidských genů kódujících proteiny má u této ryby ortology, což znamená, že většinu lidských patologických stavů lze teoreticky modelovat u ryb. Téměř každý rok se objevují nové výrazné modely. Existují rybí analogy anémie, porfyrie, kardiomyopatií, svalové dystrofie, rakoviny varlat, rakoviny jater a dokonce i Parkinsonovy a Alzheimerovy choroby (obr. 1).
1. Takto se od roku 1995 do roku 2012 měnil počet článků o výzkumu pomocí Danio rerio publikovaných za rok. Barevné čáry označují dobu výskytu „rybích“ modelů různých lidských nemocí.
Jako jeden z prvních vytvořili model porfyrie, dědičného onemocnění, při kterém je narušena biosyntéza hemu, hlavní složky hemoglobinu (Nature Genetics, 1998, 20, 239-243, doi:10.1038/3041). Ukázalo se, že stejnou funkci má u zebřiček gen pro enzym uroporfyrinogendekarboxylázu, jehož mutace způsobují porfyrii u lidí. Následně byli vytvořeni mutanti Danio rerio s odchylkami v embryonálním vývoji, což vedlo k problémům se syntézou hemu. U nich, podobně jako u lidí s porfyrií, je narušena výměna pigmentů, což znamená, že barva šupin se liší od normální.
Pozorování vývoje nádorů transplantovaných od člověka na rybách se ukázalo jako velmi pohodlné díky větší průhlednosti jejich tkání. Dříve se xenotransplantace lidských rakovinných buněk prováděla téměř výhradně u myší. Stojí za zmínku, že u ryb jsou studovány nejen pevné (solidní) nádory, ale také „tekuté“ nádory. Jsou to například leukémie T-buněk: vznikají v důsledku nadměrné exprese onkogenu Myc, který byl modelován u ryb pomocí transgenních technologií (Science, 2003, 299, 5608, 887-890, doi: 10.1126/science.1080280) .
Pomocí zebřičky lze nalézt a otestovat nové léky. U těchto ryb existuje model melanomu. Je známo, že buňky takových nádorů mají mnoho vlastností buněk neurální lišty a neurální lišta je jednou z nejdůležitějších částí embrya.
Vědci zkoumali, jaké látky by mohly zpomalit tvorbu neurální lišty zebřičky, což naznačuje, že stejné molekuly by mohly zastavit vývoj melanomů. Bylo tedy zjištěno, že antirevmatikum leflunomid inhibuje syntézu pyrimidinu a zároveň prodlužování transkripce genů aktivních při tvorbě neurální lišty (Nature, 471, 518–522, 2011, doi:10.1038/ příroda09882). U melanomových buněčných kultur se leflunomid v kombinaci s vemurafenibem ukázal jako velmi účinný. Tento pár také prošel studiemi na zvířatech a v roce 2012 začaly klinické testy kombinované terapie. O dva roky později skončily, ale jejich výsledky dosud nebyly zveřejněny.
Autismus a deprese ve vodě
Zebřičky kupodivu pomáhají studovat i takové zdánlivě čistě lidské nemoci, jako jsou deprese a poruchy autistického spektra.
Chování ryb na modelech těchto nemocí je posouzeno po záznamu na video – stejně jako ve studiích na hlodavcích. Pouze pokud se myši a krysy v testu na otevřeném poli pohybují ve dvou rovinách, pohybují se ryby v akváriu i ve třetím rozměru. Mohou klesnout hlouběji nebo mohou plavat blízko hladiny. Při vstupu do nového akvária se zebřičky zpravidla zdržují v blízkosti jeho dna a stěn. Pokud se však do vody přidá antidepresivum fluoxetin, které také tlumí úzkost, plavou v horní části akvária a hladina „stresového hormonu“ kortizolu u takových ryb se sníží. Tyto údaje jsou velmi zajímavé nejen z hlediska farmakologické léčby deprese, ale také pro environmentální studie. V USA a řadě dalších zemí není koncentrace fluoxetinu ve vodě přírodních nádrží zdaleka nulová (Environmental Science and Technology, 2010, 44,6, 1918-1925, doi: 10.1021/es9022706), a proto obyvatelé jezer a řek neustále náchylní k účinkům tohoto antidepresiva. Jaké účinky to na ně má, se teprve určí.
Danio rerio jsou společenské ryby a snadno se vzájemně ovlivňují. Dokážou tvořit hejna a při pokojné komunikaci se k sobě běžně staví čelem k sobě. Zdá se, že Danios, kteří se používají k modelování poruch autistického spektra, nevěnují svým sousedům pozornost a téměř nikdy se na ně neotočí a také si od svých sousedů udržují uctivý odstup. Mimochodem, na vývoji modelů „autistických ryb“ se podílejí i vědci z Petrohradu a Jekatěrinburgu („Experimental Neurology“, 2017, doi:10.1016/j.expneurol.2017.02.004).
2. Zebřička, u které je uměle vyvolán epileptický záchvat, plave vývrtkovým způsobem.
Zebrafish má také obdobu epilepsie. Lze ji detekovat pomocí elektroencefalografie a videozáznamů chování. Během „záchvatu“ způsobeného působením křečí se elektrická aktivita rybího mozku určitým způsobem mění. Mění se i trajektorie pohybu (obr. 2).
Žádný model není dokonalý. Daniosové jsou samozřejmě lidem docela blízcí, ale jsou mezi námi rozdíly, a to nejen v počtu končetin. Některé geny v těchto rybách jsou duplikované; jejich hematoencefalická bariéra má strukturální rysy, které naše nemají. Některé oblasti mozku, které hrají důležitou roli v chování lidí a jiných savců, se u ryb prakticky nevyvíjejí. Zebřičky navíc nejsou ze své podstaty vyživující, což je významné omezení pro výzkum autismu.
Je nepravděpodobné, že v dohledné době zebřičky doženou popularitu u takových laboratorních svítidel, jako jsou krysy a myši. Není se čemu divit: vždyť ryby jsou od nás strukturou dále než hlodavci. I když, musím se přiznat, není mi ani tak líto tichých tvorů plovoucích ve vodě jako těch ocasatých a chlupatých.
