Text vědecké práce na téma “Biotestování a mikrobiologické metody při hodnocení znečištění půdy”
MDT 502/504 M.A. Vodianova
BIO-TESTOVÁNÍ A MIKROBIOLOGICKÉ METODY PŘI HODNOCENÍ ZNEČIŠTĚNÍ PŮDY
ZhE o všech dobách, o které se člověk snažil-
-I-9 Chci vytvořit co nejpohodlnější podmínky pro život a činnost. Vzniklo mnoho podniků lehkého i těžkého průmyslu; byla vyvinuta nová území; velká města vyrostla z malých osad; byly vytvořeny dálnice – to vedlo k nevyhnutelnému znečištění životního prostředí.
Ve městech je obrovské množství čerpacích stanic, obří tankery naplněné ropou se přepravují po různých námořních trasách a kvůli nehodám a dalším vnějším faktorům dochází k rozlití. V důsledku toho jsou půda a voda v blízkých oblastech vysoce znečištěné, mění se fyzikálně-chemické vlastnosti a v důsledku toho se živé organismy v takovém prostředí chovají odlišně.
Téma této práce proto zní: „Využití biologických
metody pro hodnocení toxicity objektů životního prostředí obsahujících různé nečistoty“, které zahrnují:
1. Biotestovací metody;
2. Mikrobiologické metody.
Předmětem naší práce byla půda,
1. Charakteristika půd a jejich samočistící procesy
Půda je jediný živý organismus, který reaguje na všechny vnější podněty. Hromadění polutantů různé povahy v půdní vrstvě
půda by mohla lidem znemožnit život, pokud by současně se znečištěním neprobíhaly v půdě samočistící procesy.
Samočištění půdy je soubor procesů probíhajících v půdě a vedoucích k oslabení nebo úplnému uvolnění toxických účinků škodlivin.
Se zhoršováním samočisticí schopnosti se zvyšuje epidemické nebezpečí půdy. V kontaminované půdě klesá úroveň skutečných zástupců půdních mikrobiálních společenstev (antagonistů patogenní střevní mikroflóry) a její biologická aktivita, ale zvyšuje se počet pozitivních nálezů patogenních enterobakterií a geohelmintů, které jsou odolnější vůči chemickému znečištění půdy.
Půdy nacházející se v hranicích velkých měst jsou silně ovlivněny antropogenním faktorem, který zahrnuje jak narušení přirozeného složení a složení půdy, tak i pronikání různých znečišťujících látek do ní. V důsledku toho vzniká zcela zvláštní „typ“ půdy – městská půda nebo urbanozem.
Pro srovnání vlivu expozice polutantu, zejména oleji, bylo v experimentu rozhodnuto použít jak městskou půdu, tak půdu typickou pro náš region, konkrétně sodno-podzolovou půdu.
Městské půdy jsou definovány jako půdy s umělou povrchovou vrstvou o tloušťce větší než 50 cm, získané smícháním, nakopením, zakopáním nebo kontaminací materiály městského původu (stavební a domovní odpad).
Je třeba říci, že půda nasycená organickým olejem a benzínem se nazývá intruze.
Pro tento experiment byla vybrána půda z centrální části Moskvy (CAO) z ulice Pogodinskaya (na povrchu nebyl žádný beton).
Tato půda byla vybrána na území biologické stanice Moskevské státní univerzity Chashnikovo v okrese Solnechnogorsk v Moskevské oblasti na okraji lesa bez drnu.
2. Charakteristika ropy
Za účelem studia vlivu ropy na půdu byl proveden experiment, ve kterém byla ropa odebrána z pole Tarasovskoye v oblasti Purovsky (západní Sibiř).
Byly studovány následující koncentrace: 25; 50; 100; 200; 300 a 500 ml/kg půdy, což odpovídá nízké (25-50), střední (100, 200) a vysoké (300-500) úrovni znečištění. Nejnovější koncentrace ukazují úrovně úniků ropy v přírodě.
Nedílnou součástí je biotestování
metoda analýzy kvality objektu životního prostředí, při které se používají laboratorní standardy
kladené předměty (testovací objekty1). Za experimentálních podmínek zaznamenáno
1 Předmět studia, výzkum jakýmkoli způsobem, metoda. Na základě stavu testovaného objektu lze posoudit vlastnosti jeho stanoviště (přirozeného nebo umělého).
jejich reakce na antropogenní dopady.
Celkovým úkolem a výsledkem využití biotestování je zajištění ekologické pohody biologických objektů.
K hodnocení toxicity2 se používají různé testovací objekty – mikroorganismy, akvarijní ryby, řasy, zvířecí a lidské buněčné kultury atd.
Toto testování bylo provedeno pomocí následujících testů:
organismy — zástupci různých systematických skupin: prvoci — nálevníci Teiiabyshena paraguergiosti8, geneticky upravený kmen bakterií
“Ecolum” a buněčný testovací objekt (granulované býčí spermie).
Příprava vzorků pro biotestování
Zpočátku bylo odebráno 14 vzorků půd: 7 vzorků městské půdy a 7 vzorků sodno-podzolové půdy s koncentracemi oleje: 25, 50, 100, 200, 300, 500 ml/kg a kontrolní, tedy bez kontaminace. Vzorek destilované vody byl odebrán zvlášť. Odpovídající extrakty byly získány vícestupňovou filtrací.
Některé ze získaných filtrátů byly předloženy Všeruskému výzkumnému ústavu lékařské technologie Ministerstva zdravotnictví Ruské federace k provedení experimentu ke stanovení toxicity pomocí býčích spermií jako buněčného testovacího objektu. Druhá část byla použita pro biotestování a mikrobiologickou metodu.
Biotestovací metoda pro hodnocení kvality vody v systémech zásobování pitnou vodou pomocí nálevkovitých kultur
2 Schopnost látky, která v určitých množstvích vstoupí do těla člověka, zvířete nebo rostliny, způsobí otravu nebo smrt.
Generativní neboli růstová funkce nálevníků je důležitým ukazatelem jejich životaschopnosti a spočívá ve sledování množení tetrahymen jak ve studovaných extraktech, tak v kontrole (dechlorovaná vodovodní voda). 5 ml kultury tetrahymena s počáteční koncentrací 0,05 – 100 buněk/ml bylo umístěno do 200 ml vzorků extraktu. Experiment byl opakován třikrát; doba expozice 6 a 48 hodin. Prvních 6 hodin pozorují především přežívání nálevníků (akutní prožitek), ve zbytku času nárůst počtu nálevníků. Nálevníci jsou velmi citliví na malé koncentrace znečišťujících látek vstupujících do vodních ekosystémů. Jejich krátký životní cyklus vývoje umožňuje rychle identifikovat povahu působení toxických látek.
Snadná kultivace a dostupnost výzkumu umožňují použití tohoto testovaného objektu nejen v laboratorních, ale i v polních podmínkách.
Indikátory toxicity testovaného vzorku jsou potlačení rychlosti růstu buněk řasinek (v chronickém experimentu3 – do 96 hodin) a jejich odumření (v akutním experimentu4 – 15 minut, 1 hodina).
Pro rychlé posouzení toxicity vzorku extraktů se sleduje počet živých buněk po 15 minutách a po 1 hodině. Při chronické zkušenosti, jako v našem případě, po 24, 48 hodinách současně.
3 Tento experiment může trvat asi 30 dní pro důkladnější a hlubší studium toxických vlastností daného předmětu.
4 Tento zážitek může trvat přibližně 96 – 120 hodin
a umožňuje určit přítomnost a nepřítomnost
akutní toxické účinky zkoušené látky.
Kritérium toxicity (K) je rychlost reprodukce, za kterou se považuje relativní zvýšení počtu buněk v 1 ml studovaného filtrátu. Vzorky by měly být považovány za toxické, pokud je hodnota K < 50 %.
Biotestování pomocí buněčného testovacího objektu – granulovaného býčího spermatu
Metoda je založena na analýze změn v závislosti spermií na čase. Jako míra toxicity testovaného roztoku se bere hodnota indexu toxicity II. Čím nižší je hodnota J, tím silnější je inhibiční účinek testovaného roztoku na suspenzi spermií.
Výsledek testu je považován za netoxický pro celý organismus savců, to znamená, že nemá obecný toxický účinek při jednorázovém podání, pokud je hodnota I v rozmezí od 70 do 120 %. Pokud jsou získány hodnoty indexu toxicity nižší než 70 % a více než 120 %, vzorek je považován za toxický, to znamená, že má obecný toxický účinek na celé tělo savce při jediné injekci.
Uživatel této techniky má tedy možnost po provedení testu k posouzení cytotoxicity6 na býčím spermatu předpovědět obecný toxický účinek testovacího roztoku na celé tělo savce.
Metoda pro rychlé stanovení toxicity půdních filtrátů pomocí luminiscenčních bakterií
5 Spolehlivá kvantitativní hodnota testovacích parametrů, nejčastěji používané jsou přežití, fertilita, potlačení enzymatické a metabolické aktivity organismů.
6 Působení jedu na buněčné úrovni.
skupina T hodnota Závěr o stupni toxicity analyzovaného vzorku
1 Méně než 20 Přípustný stupeň toxicity
2 Od 20 do 50 Vzorek je toxický
3 Rovná se nebo větší než 50 Vzorek je vysoce toxický
Test „Ecolum“ (světelné bakterie)
Biosenzor Ecolum používaný při testování je bakterie, ve které jsou metabolické procesy doprovázeny luminiscencí ve viditelné části spektra. Při vystavení toxickým sloučeninám různé povahy se v bakteriích mění biochemické reakce, což se projevuje změnou jejich záře.
Intenzitu bioluminiscence zaznamenává přístroj Biotox-6. Hodnotícím kritériem je index toxicity (T), který normálně nepřesahuje 20% rozdíl od kontroly. Stimulace luminiscence není indikátorem toxického účinku vzorků na luminiscenční funkci bakterií. Technika je založena na stanovení změn v intenzitě bioluminiscence7 geneticky upravených bakterií při vystavení toxickým látkám přítomným v analyzovaném vzorku ve srovnání s kontrolou.
Kritériem toxického působení je změna intenzity bioluminiscence testovaného objektu v testovaném vzorku oproti intenzitě u vzorku s roztokem, který neobsahuje toxické látky. Pokles intenzity bioluminiscence je úměrný toxickému účinku.
4. Mikrobiologická metoda
Půda je přirozeným prostředím pro širokou škálu mikroorganismů. Studie byly provedeny na hlavních skupinách půdních mikroorganismů:
7 Intenzivní záře ve viditelné oblasti spektra odrážející specifickou metabolickou aktivitu organismů.
saprofytické bakterie, půdní mikromycety a aktinomycety. Každý gram horní vrstvy obsahuje miliony, dokonce miliardy takových organismů. Tato biomasa s velmi velkým aktivním povrchem má významný vliv na procesy probíhající v půdě a na její úrodnost. Mikroorganismy ničí organické látky vstupující do půdy a přeměňují jejich organické prvky na formy, které jsou asimilovány rostlinami.
Stanovení mikroorganismů v půdě
Údaje o studiu znečištění půdy naznačují větší citlivost na působení některých chemikálií půdních aktinomycet a hub ve srovnání s půdními sporovými a nesporovými bakteriemi. Není pochyb o tom, že takovou nerovnováhu v půdní mikrobiocenóze je třeba považovat za negativní jev. Aktinomycety a houby hrají velkou roli v přeměně širokého spektra organických a minerálních látek a pro své extrémně výrazné antagonistické a toxické vlastnosti mají velký vliv na tvorbu mikrobiálních půdních cenóz a jsou producenty mnoha fyziologicky aktivních látek. látky – aminokyseliny, enzymy a vitamíny.
K počítání půdních hub se zpravidla používá ředění půdní suspenze 1:100 (102), při počítání aktinomycet – 1:1000 (103) a při počítání saprofytických bakterií – 1:10000 (104). Výsev se provádí povrchovou metodou, aplikovanou na agarové médium.
0,1 – 0,05 ml suspenze. Médium Gause 1 se používá k počítání aktinomycet, médium Czapek se používá k počítání hub a médium MPA se používá k počítání saprofytických bakterií. Při počítání plísní se do média přidávají látky, které inhibují růst bakterií – například antibiotikum streptomycin, které se přidává bezprostředně před výsevem do roztaveného média.
Podle ustanovení Metodických doporučení pro hygienické zdůvodnění MPC chemických látek v půdě se výsledky pokusu posuzují porovnáním počtu kolonií vyrůstajících z půdy pokusných a kontrolních nádob. Za účinnou koncentraci chemické látky se považuje taková koncentrace, která má výrazný inhibiční účinek alespoň 50 % vzhledem ke kontrole.
Počet hub a aktinomycet se vypočítá 7. – 10. den inkubace a saprofytických bakterií – 3. den.
5. Výsledky výzkumu
Závěr 1: Pro městskou půdu je minimální účinná koncentrace (dále jen MAC) oleje 50 ml/kg půdy. Vliv této koncentrace se projevil na luminiscenční funkci bakterií Ekolum. Vliv na generativní funkci nálevníků byl zjištěn již od koncentrace 300 ml/kg půdy. Studované vzorky půdy neměly žádný toxický účinek na behaviorální funkci býčích spermií.
Závěr 2: Pro sodno-podzolovou půdu byla hodnota MND 25
ml/kg půdy na generativní funkci nálevníků. Testy luminiscence bakterií Ekolum a behaviorální funkce spermií neposkytly konzistentní výsledky.
Závěr: Využití navržených biotestů tedy umožňuje posoudit kvalitu ropou kontaminovaných půd a stanovit hodnoty MND ropy.
Biotestovací metody se používají nejen k hodnocení toxicity kontaminovaných objektů životního prostředí, ale také k hodnocení různých technologických procesů, například způsobů úpravy vody pro různé účely: metody čištění, korelace a tak dále.
Mikrobiologické metody Na základě výsledků mikrobiologických studií bylo zjištěno:
Závěr 1: Inhibice růstu mikromycet a aktinomycet ve všech experimentálních vzorcích půdy;
Závěr 2: Aktivní stimulace růstu saprofytických bakterií od prvního dne inkubace;
Závěr 3: Pokles diverzity bakterií a mikromycet byl detekován ve všech experimentálních vzorcích ve srovnání s kontrolou, počínaje 3. dnem výzkumu;
Závěr 4: MND oleje pro městskou půdu byla stanovena na základě jeho účinku na půdní aktinomycety, jejichž inhibice růstu (více než 50 % kontroly) byla pozorována při koncentraci oleje 25 ml/kg půdy.
Vodianova M.A. — Moskevská státní báňská univerzita.
