Denis Borisovič Tichonov,
doktor biologických věd, vedoucí Laboratoře biofyziky synaptických procesů, Ústav evoluční fyziologie a biochemie pojmenovaný po. I. M. Sechenov RAS
“Chemie a život” č. 3, 2014
Jedy přírodního původu jsou mimořádně zajímavým objektem pro výzkum. Teprve v posledních desetiletích se vešlo ve známost, jaké úžasné molekulární struktury vytvořila evoluce, aby byly malé žáby z kolumbijských lesů nebo pufer ryby smrtící. Je známo obrovské množství rostlinných, živočišných a bakteriálních toxinů – možná v této oblasti biochemie zahanbuje anorganickou chemii a řešení problému zneškodnění nepřítele v podání živé přírody jsou mnohem elegantnější. Podívejme se na několik, spojených společným cílem – všechny ovlivňují napěťově řízené sodíkové kanály v membránách nervových buněk.
Něco málo o cíli
Napěťově řízené sodíkové kanály jsou klíčovým prvkem nervového systému zvířat. Když je neuron v klidu, na jeho membráně (což je kondenzátor) se díky činnosti speciálních systémů udržuje určitý elektrický potenciál. V tomto okamžiku jsou sodíkové kanály uzavřeny. Když se membrána depolarizuje, reagují na pokles membránového potenciálu a otevírají se (odtud název „voltage-gated“; existují další kanály, jako jsou kanály s ligandovou bránou, které se otevírají nebo zavírají v reakci na přidání specifické molekuly ). Ionty Na + proudí do buňky, přenášejí kladný náboj zvenčí dovnitř – klidový potenciál je nahrazen potenciálem akčním.
Struktura sodíkového kanálu bakterií Arcobacter butzleri (Horn R., Příroda, 2011, 475, 305–306). Kanály mají tetramerní strukturu – čtyři samostatné podjednotky nebo čtyři repetice v jednom proteinovém řetězci tvoří pór ve středu (а). Kontrolní domény jsou umístěny na periferii; obsahují potenciální senzory, které nesou kladný náboj a posunují se v membráně při změně elektrického pole. Nejužší část kanálu – selektivní filtr – je tvořena P-smyčkami a ve spodní části (nejblíže vnitřní straně membrány) jsou „brány“ (б). Když jsou vnitřní spirály rovné a složené do „copu“, kanál se uzavře a při aktivaci se ohýbají do stran a tvoří otevřenou předsíň kanálu, která umožňuje průchod iontů.
Tvorba a šíření akčních potenciálů je základem fungování celého nervového systému a hlavní roli zde mají napěťově řízené sodíkové kanály. Je jasné, že jedním z nejrychlejších a nejúčinnějších způsobů, jak zneškodnit nepřítele, je narušit činnost jeho nervového systému. Sodíkové kanály jsou proto vynikajícím cílem pro různé toxiny.
Iontový kanál je molekula proteinu, která překlenuje lipidovou dvojvrstvu buněčné membrány. Stejně jako mnoho jiných proteinů je kanál „sestaven“ ze dvou velkých domén – bloků odpovědných za základní funkce. Kanály mají obvykle alespoň dvě domény: jedna tvoří skutečný pór v membráně a druhá reaguje na vnější vlivy a řídí otevírání a zavírání pórů. Sestavení komplexních proteinů z takto velkých bloků poskytuje rozsáhlé možnosti pro jejich molekulární evoluci. Další typickou technikou evoluce je vytvoření rodin proteinů, které jsou homologní (to znamená, že mají stejný původ a společnou základní strukturu). Různými změnami vlastností „prototypu“ příroda získává podobné proteiny s různou specializací. Napěťově řízené sodíkové kanály jsou tedy homologní s řadou dalších kanálů – především napěťově řízenými draslíkovými a vápníkovými kanály. Liší se především konstrukcí „selektivního filtru“ – úzkého úseku póru, kde na základě jemných molekulárních interakcí dochází k selekci iontů, pro které je kanál propustný.
První podrobné informace o struktuře kanálů této rodiny – výsledky rentgenové difrakční analýzy pro draslíkové kanály v bakteriích – byly zveřejněny v roce 1998. Vedoucí práce Roderick MacKinnon z Rockefellerovy univerzity v New Yorku se stal laureátem Nobelovy ceny za chemii o pouhých pět let později, v roce 2003, takže význam těchto výsledků pro vědeckou komunitu byl tak zřejmý. Bez nadsázky otevřeli novou éru v pochopení struktury a funkcí iontových kanálů.
Téměř všechny strukturální prvky kanálu se mohou stát cílem toxinů. Budeme se zabývat pouze třemi typy toxinů, které ovlivňují póry sodíkového kanálu. Tetrodotoxin pufferových ryb, konotoxiny měkkýšů Conus a batrachotoxin z listolezeckých žab – tři nezávislé „vojenské vývojové trendy“, které řeší stejný problém.
Než přejdeme k tomu, jak toxiny fungují (a dostatečně podrobně popíšeme „mechaniku“ jejich práce, někdy s atomovým rozlišením), uděláme ještě jednu odbočku. Odkud tyto informace pocházejí? Zdá se, že v 21. století je možné „jen se dívat“, tedy získat rentgenovou strukturu kanálu v kombinaci s toxinem. Ale nebylo to tam. Problém je v tom, že kanály nejsou ve vodě rozpustné proteiny: existují uvnitř membrány, přičemž vnější a vnitřní části jsou ve vodném prostředí. Získání krystalů pro takové proteiny je neuvěřitelně obtížný úkol, a pokud žádné krystaly nejsou, neexistuje žádná rentgenová difrakční analýza. I když se od MacKinnonova průlomu objevilo velké množství struktur rentgenových kanálů, obecně není problém zdaleka vyřešen. Každá nová struktura je plodem mnoha let metodických triků a má doslova cenu zlata. Zejména pro napěťově řízené kanály obratlovců, které nás zajímají (včetně praktických potřeb), takové struktury neexistovaly a neexistují. Navíc, bohužel, v komplexech s toxiny.
Data, která mají vědci k dispozici, byla sbírána doslova kousek po kousku. Za prvé, toto jsou výsledky obrovského úsilí neurovědců, kteří popisují účinek toxinů na buňku a tělo – výsledný efekt není těžké si všimnout, ale je potřeba speciálních experimentů, abychom pochopili, co přesně se stalo, když toxin pracoval. Pak je to práce neurochemiků a farmakologů, kteří přišli na to, jak závisí účinky toxinů na jejich strukturách. Dále přichází na řadu molekulární biologové – získají mutantní experimentální zvířata, aby ukázali, jak ta či ona mutace mění citlivost na jed. (Samozřejmě se v přírodě mohou vyskytovat i jedinci a dokonce i druhy odolné vůči jedům: v evoluci je vždy prostor pro „závody ve zbrojení.“) Pokud víte, který aminokyselinový zbytek v které části bílkoviny je nahrazen u zvířete odolného na toxin, můžeme dojít k závěru, že s To je místo, kde se toxin váže. K rekonstrukci strukturního obrazu působení jedů jsou využívána data z rentgenové difrakční analýzy příbuzných proteinů, které mají podobnou strukturu. Dělají to teoretici, kteří vyvíjejí molekulární modely a snaží se vměstnat celý soubor heterogenních dat do jediného konceptu. K těm druhým patří i autor článku.
Tetrodotoxin jako dopravní zácpa
Ryba Fugu je japonská pochoutka oblíbená mezi milovníky vzrušení. “Pokud chcete jíst fugu, napište závěť,” “Kdo jí fugu, je hloupý, a kdo nejí, je také hloupý.” Fugu se vyrábí z několika druhů ryb z čeledi pufferfish (Tetraodontidae). Ne všechny papoušky jsou jedovaté a i v rámci nebezpečného druhu jsou možné odchylky v tomto ukazateli – například méně jedovaté ryby lze získat v akvakultuře kontrolou jejich stravy. Vařit rybu smějí však pouze kuchaři se speciálními certifikáty. Sebemenší porušení technologie a gurmán, který dostal část tetrodotoxinu, zemře. To není vtip: každý rok se stane několik takových případů.
Tetrodotoxin je jedním z nejaktivnějších toxinů v přírodě. (Abych byl spravedlivý, v posledních letech mezi vědci roste názor, že tetrodotoxin neprodukují samotné ryby, ale bakterie rodu Vibrio, žijící v jejich těle.) Studiu, jak a kde se tato složitá molekula váže na sodíkový kanál, bylo přirozeně věnováno mnoho práce, prováděné po několik desetiletí. Víceméně pochopit tuto problematiku však bylo možné poměrně nedávno. Tetrodotoxin se váže ve vnějším vestibulu kanálu, přesně tam, kde je umístěn selektivní filtr. Pokud použijeme ne zcela vědeckou terminologii, pak lze tuto akci přirovnat k ucpání láhve zátkou. A kónický tvar molekuly tetrodoxinu takovou analogii naznačuje.
Jako zátka vstupuje tetrodotoxin do vnějšího vestibulu sodíkového kanálu. Navíc každá z jeho aktivních skupin interaguje se svým aminokyselinovým zbytkem (viz obrázek vpravo)
Abyste pochopili důvody neobvykle vysoké aktivity tetrodotoxinu, musíte se blíže podívat na samotnou molekulu. Je relativně malý, ale má pevný rám, který je „zdoben“ velkým množstvím funkčně aktivních skupin. Je úžasné, že podle experimentů má KAŽDÝ z nich v póru svého specifického „respondéra“ (viz obrázek). Geometrie samotného tetrodotoxinu navíc téměř dokonale odpovídá nálevkovité struktuře vnějšího vestibulu kanálu. Nejmenší změny ve struktuře toxinu nebo kanálu narušují chemicko-sterickou komplementaritu a vedou k prudké ztrátě aktivity.
Konotoxin jako víko
Molekuly zcela jiného typu – konotoxiny, které jsou syntetizovány dravými plži rodu Conus. Stejně jako mnoho jiných jedovatých tvorů jsou šišky velmi krásné, s velkými, hladkými skořápkami pokrytými složitými vzory. Jed jim pomáhá získat potravu: šišky vyvrhnou zvláštní výrůstek ústního aparátu, jako harpunu s otrávenou špičkou, a zasáhnou jím jiné měkkýše nebo ryby. Jejich jed je ale pro člověka velmi nebezpečný.
Konotoxiny jsou peptidy, obvykle s několika cysteinovými S-S můstky, které zajišťují více či méně tuhé uspořádání aminokyselinového řetězce. Navíc, pokud je tetrodotoxin jednou vysoce specifickou molekulou, pak čípky produkují mnoho peptidových toxinů, které patří do různých rodin a útočí na různé cíle.
Vysoce specifické jsou také ty, které působí na napěťově řízené kanály, takzvané mu-konotoxiny. Vážou se ve stejném vnějším vestibulu sodíkového kanálu jako tetrodotoxin. Ale jejich velikosti jsou zcela odlišné – peptidový toxin nemůže projít úzkou částí kanálu, takže sedí na kanálu shora. Pokračujeme v naší analogii, toto už není korek, ale víko.
škeble Conus textilie a struktura konotoxinu. Vpravo – konotoxin v kanálu; na rozdíl od tetrodotoxinu pokrývá kanál shora
Peptidové toxiny (na rozdíl od tetrodotoxinu) však mají určitou flexibilitu. Není možné takové víčko pevně přitlačit, aby neproklouzl ani malý iont sodíku. Proto konotoxiny implementují jinou strategii k zablokování kanálu. Aby vstoupil do jeho úzké části, musí tam kladně nabitý iont sodíku interagovat se záporně nabitými zbytky aspartátu a glutamátu. Takové interakce umožňují iontu zbavit se „plášťů“ molekul vody. Jsou to aspartáty a glutamáty z vnějšího vestibulu, které konotoxiny loví. Má mnoho kladně nabitých zbytků lysinu a argininu. Tyto zbytky, jako chapadla chobotnice, sestupují do předsíně kanálu a vážou zbytky aspartátu a glutamátu nezbytné pro průchod sodíku. Výsledkem je, že kanál není zcela zablokován, ale stále je blokován.
Je zajímavé, že některé mu-konotoxiny (včetně uměle vytvořených mutantů) neblokují vodivost úplně, ale pouze ji do té či oné míry snižují. Dlouho nikdo nechápal, jak se tato zbytková vodivost realizuje. Nyní se nám zdá, že pokud má konotoxin určitý nedostatek kladně nabitých aminokyselin, nemůže imobilizovat a neutralizovat všechny zbytky potřebné pro vedení sodných iontů a tam, kde alespoň jeden z nich zůstane volný, mohou ionty stále procházet do kanálu.
Batrachotoxin jako spacer
Třetí třídou sloučenin, které působí na napěťově řízené sodíkové kanály, je batrachotoxin jihoamerických žab šplhavých (Phyllobaty). Je pozoruhodné, že jejich strava je činí jedovatými: alkaloidy nezbytné pro syntézu batrachotoxinu jsou obsaženy v členovcích, kterými se v přírodě živí; Novorození listolezci a chovaní v zajetí jsou nejedovatí. Jedná se o jeden z nejsilnějších jedů: semiletální dávka vypočtená pro orální užití je 2–7 mcg/kg (pro strychnin např. miligramy na kilogram, pro tetrodotoxin – stovky mikrogramů na kilogram).
Listolezec je hrozný Phyllobates terribilis
Jsou známy také analogy batrachotoxinu jiného původu. Nejznámější z nich jsou rostlinné toxiny veratridin a akonitin. Jak je vidět na obrázku, jedná se o poměrně složitě organizované organické sloučeniny a složitá je také fenomenologie jejich působení na sodíkové kanály.
Jejich hlavní rozdíl od tetrodotoxinu a konotoxinů diskutovaných výše spočívá v tom, že neblokují kanál. Naopak, vázání těchto toxinů způsobuje, že kanál zůstává otevřený a neustále umožňuje iontům procházet. Ale ačkoliv je mechanismus účinku zcela opačný, biologický účinek je stejný – pro oběť žalostný. V obou případech je generování a šíření akčních potenciálů nemožné, protože jsou narušeny mechanismy normální aktivace kanálu řízené membránovým potenciálem.
Dlouho se věřilo, že batrachotoxin a jeho analogy působí na kanál přes lipidovou fázi (protože jsou schopny pronikat membránou) a záhadně mění jeho vlastnosti. Tento koncept přetrvával, dokud nebyla k dispozici data o bodových mutacích. Jednoznačně prokázali, že tyto toxiny se musí vázat v póru iontového kanálu a nikde jinde. Co tam dělají, že se vlastnosti kanálu tak radikálně mění? To zůstávalo poměrně dlouho záhadou a jeho řešení jako první navrhl můj kolega B.S. Zhorov.
Molekula batrachotoxinu sedí v kanálu a zabraňuje jeho uzavření, což umožňuje průchod iontů sodíku. Šipka zobrazen iontový proud
Pokud se podíváme na prostorovou strukturu batrachotoxinu, veratridinu a akonitinu, uvidíme, že jsou charakterizovány přítomností kyslíkové triády: každá molekula obsahuje tři atomy O uspořádané určitým způsobem. Předpokládalo se, že jsou potřebné pro specifickou vazbu. Boris Solomonovič Zhorov si všiml, že tyto tři kyslíky v molekule toxinu v geometrii přesně odpovídají kyslíkům molekul vody z prvního hydratačního obalu iontu Na +.
Odtud vznikl model, který jsme vyvinuli později. Jeho podstatou je, že molekula toxinu se váže v póru kanálu a současně přeměňuje tyto tři stejné kyslíky do póru. A přestože je v kanálku takto relativně velká molekula, neblokuje ho, propustnost pro sodíkové ionty je zachována – lze říci, že molekula batrachotoxinu je pro ionty kluzká, právě díky kyslíkové triádě. Tento předpoklad umožnil vysvětlit všechny hlavní efekty. Abychom znovu použili nevědeckou analogii, batrachotoxin je druh spaceru, jako je stent, který chirurg zavede do cévy oběhového systému, aby zabránil jejímu zhroucení. Batrachotoxin, veratridin a akonitin sedí v kanálu, prasknou jej a nedovolí, aby se uzavřel, čímž je zajištěn nepřetržitý tok iontů.
Na základě tohoto konceptu bylo provedeno několik prací, byly předpovězeny nové mutace a všechny naše předpoklady byly docela dobře potvrzeny. K dnešnímu dni se jedná o nejmodernější pochopení toho, jak tato třída napěťově řízených aktivátorů sodíkových kanálů funguje.
Na několika příkladech jsme tedy viděli, jak rozmanité a sofistikované mohou být molekulární mechanismy působení toxinů na sodíkové kanály. A to je jen pár střípků z obrovské mozaiky účinků toxinů na konkrétní proteiny. Mnoho problémů stále zůstává nevyřešeno.
Proč je to všechno nutné?
Praktické výhody takového základního výzkumu jsou zřejmé. Z celkového objemu lékařské farmakologie se asi 10 % sloučenin zaměřuje na iontové kanály. Jsou to anestetika, analgetika, antiarytmika a mnoho dalších tříd farmakologických látek. Každý, kdo někdy navštívil zubaře, se v praxi setkal s blokátory kanálů řízených napětím. Koneckonců, lokální anestetika používaná k úlevě od bolesti jsou také blokátory těchto kanálů. Jejich jediným rozdílem od tetrodotoxinu je, že působí pouze ve vysokých koncentracích – jinými slovy, pouze v blízkosti místa vpichu. Lokální anestetika zabraňují vzniku akčních potenciálů, a tedy přenosu signálů bolesti do mozku.
Moderní medicína neustále potřebuje nová aktivní a selektivní farmakologická činidla, aby co nejvíce minimalizovala vedlejší účinky užívání drog. Obrovské množství peněz se vynakládá na vývoj nových léků. Jak ale hledat nové látky, když nevíme, jaké jsou mechanismy účinku již známých sloučenin? Náhodné vyhledávání je příliš drahé. Racionální hledání může být založeno pouze na hlubokém vědeckém pochopení mechanismů účinku léků – v celém rozsahu od molekul až po celé organismy.
