Před 40 lety se věřilo, že do úplného vítězství nad tuberkulózou zbývá velmi málo času. Naději skýtalo rozsáhlé očkování a rozšířené používání účinných antibiotik, jako je isoniazid a rifampicin. Již na počátku 1990. let se však objevily kmeny tuberkulózy, které byly rezistentní vůči existujícím lékům, a nemoc se opět stala celosvětovou hrozbou. Dnes je podle zprávy WHO za rok 2018 na seznamu deseti hlavních příčin úmrtí na světě.
Ve vysoce rizikové oblasti
Pokud analyzujeme statistiku úmrtnosti na jednoho konkrétního infekčního agens, pak vede tuberkulóza. Vyžádá si více životů než HIV/AIDS. V roce 2017 na něj zemřelo 1,3 milionu lidí, zatímco na HIV/AIDS zemřelo 300 tisíc pacientů.
Podle WHO byla v roce 10 diagnostikována tuberkulóza asi 2017 milionům lidí. A tato čísla mohou růst, protože podle odhadů WHO žije s latentní tuberkulózou asi 1,7 miliardy lidí, tedy 23 % světové populace. To znamená, že téměř u každého čtvrtého člověka se může někdy vyvinout aktivní forma onemocnění.
„Rusko, Indie a Čína jsou ve vysoce rizikové zóně. V roce 2018 byla v těchto zemích registrována téměř polovina případů primární infekce kmeny tuberkulózy rezistentními na isoniazid a rifampicin. Rezistentní tuberkulóza se vyznačuje rychlým postupem a těžkým průběhem onemocnění, často vedoucím k patologickým procesům, proto WHO věnuje jejímu šíření zvláštní pozornost. A na Sibiři a na Dálném východě je situace horší než v jiných regionech Ruska. Incidence tuberkulózy i prevalence rezistentních forem jsou zde dvakrát vyšší než celostátní průměr,“ vysvětluje Elena Ufimtseva, kandidátka biologických věd, vedoucí výzkumná pracovnice Laboratoře lékařské biotechnologie, Výzkumný ústav biochemie, Federální výzkumné centrum pro základní výzkumy. a translační medicína (FRC FTM).
Hrozba je tak vážná, že ji nelze ignorovat. Ve svém projevu na první celosvětové ministerské konferenci WHO „Konec tuberkulózy“ v listopadu 2017 ruský prezident vyzval delegáty, aby spojili síly a společně vyvinuli účinné diagnostické a léčebné nástroje.
Výsledky společné práce pracovníků Výzkumného ústavu biochemie FRC FTM v Novosibirsku a Uralského výzkumného ústavu ftizeiopulmonologie již prokázaly, že tento přístup je plodný. Poprvé, když získali živé buňky s patogeny tuberkulózy z lidské plicní tkáně, vyvinuli metody, které převrátily tradiční představy o diagnostice a léčbě smrtelné nemoci.
Vezměte zajatce
Abyste pochopili, jak nové techniky fungují, musíte pochopit mechanismus onemocnění. Tuberkulózu způsobuje patogenní mikroorganismus Mycobacterium tuberculosis, který lidé daleko od medicíny znají jako „Kochův bacil“. K lidem se dostane prostřednictvím vzdušných kapiček.
V lidských plicích se s ním setkávají speciální buňky – alveolární makrofágy, jejichž hlavním úkolem je chránit dýchací orgány před mikroby a všemi dalšími cizími činiteli, kteří je mohou poškodit. To je první ochranná bariéra proti jakékoli infekci. Makrofágy však nejsou vždy schopny porazit Kochovy bacily.
Přečtěte si také
“Nikdo nevěřil v můj úspěch.” Jak se jednomu lékaři podařilo vytvořit chirurgické oddělení
„Zda člověk dostane tuberkulózu, nebo ne, závisí na tom, zda se makrofágy v jeho plicích dokážou vypořádat s patogeny tuberkulózy. Pokaždé na tom závisí průběh dalšího vývoje infekce. Pokud jsou makrofágy schopny zachytit a zničit mykobakterie, nic člověka neohrožuje. Během dlouhé evoluce, kterou patogeny tuberkulózy prošly s lidmi, si však vyvinuli mechanismy, které jim pomáhají potlačit baktericidní funkci makrofágů,“ vysvětluje Natalya Eremeeva, kandidátka biologických věd, vedoucí výzkumná pracovnice Uralského výzkumného ústavu ftiziopulmonologického ministerstva. Zdraví Ruské federace.
Pokud infekce překoná první ochrannou bariéru, mykobakterie proniknou do makrofágů a kolonizují je. Kochovy bacily přitom mohou žít uvnitř hostitelských buněk roky a dokonce desetiletí, aniž by se rozmnožovaly.
Jde o latentní tuberkulózní infekci, která podle odhadů WHO postihuje čtvrtinu světové populace. A pak se mykobakterie mohou náhle aktivovat a člověk onemocní. Proto je tak důležité posoudit obsah Kochových bacilů v makrofázích a jejich funkční stav v plicích konkrétního člověka.
„Bohužel se o tom zatím ví málo. Studie vztahu mezi Mycobacterium tuberculosis a hostitelskými buňkami se provádějí především tehdy, když laboratorní kmeny Mycobacteria infikují trvalé buňky, tj. transformované rakovinné buněčné linie nebo buňky získané z myších a lidských organismů, obvykle z krve. Je však zřejmé, že získané údaje nelze považovat za skutečný obraz patogeneze tuberkulózní infekce v plicích konkrétního člověka. Jsou zapotřebí nové přístupy ke studiu mechanismu onemocnění,“ je přesvědčena Elena Ufimtseva.
Zachyťte nepřítele živého
Na klinice Uralského výzkumného ústavu ftizeiopulmonologie se každý den provádí několik operací k odstranění fragmentů plic nejvíce postižených infekcí pacientům s tuberkulózou. Elena Ufimtseva navrhla použít část odebrané tkáně k izolaci alveolárních makrofágů infikovaných patogeny. Ufimtseva již vyvinula technologii pro získávání a kultivaci živých infikovaných buněk ze zánětlivých útvarů ve Výzkumném ústavu biochemie na laboratorních myších.
Přečtěte si také
Vůbec ne jako v seriálu. Novosibirští chirurgové operaci znesnadňují než transplantaci srdce
Vývoj infekčního procesu u plicní tuberkulózy u lidí a myší je však výrazně odlišný. Ufimceva a Eremeeva proto vyvinuli novou techniku, která poprvé umožnila izolovat živé cíle infekce – makrofágy postižené mykobakteriemi – z plic pacientů, kteří museli být operováni, protože medikamentózní terapie selhala.
„Začali jsme spolupracovat v srpnu 2014 a v červenci 2016 jsme získali první patent Ruské federace na vynález „Metoda získávání ex vivo kultur alveolárních makrofágů z chirurgického materiálu pacientů s plicní tuberkulózou a metoda hodnocení virulence (virulence je schopnost infikovat lidské tělo – přibližně TASS) Mycobacterium tuberculosis pomocí ex vivo kultur alveolárních makrofágů,“ říká Elena Ufimtseva.
Aniž bychom zabíhali do detailů, patentovaná technologie vypadá takto: když se na operačním sále odeberou úlomky plic postižených tuberkulózou, část tkáně je okamžitě odeslána do mikrobiologické laboratoře. Tam se za sterilních podmínek zpracují, izolují se imunitní buňky, které se umístí do jamek destičky se živným médiem.
“Za méně než jeden den se makrofágy přichytí na dno díry a vytvoří jedinou vrstvu buněk,” pokračuje Elena Ufimtseva v příběhu. „Po 16–18 hodinách, kdy je operovaný pacient ještě na jednotce intenzivní péče, již dostáváme buněčné kultury, které lze vyšetřit pod mikroskopem. Jsme schopni posoudit, do jaké míry jsou makrofágy infikovány mykobakteriemi, jaký je funkční stav původce onemocnění a samotných hostitelských buněk a také jak virulentní jsou bakterie v plicích pacienta s tuberkulózou atp. čas operace.”
Čím jsou mykobakteria virulentnější, tím jsou nebezpečnější nejen pro samotného pacienta, ale i pro jeho okolí. „Posouzení virulence je důležité nejen pro další léčbu pacienta, ale také pro lékaře. Musí vědět, kteří pacienti jsou infikováni vysoce virulentními mykobakteriemi, aby se sami nenakazili, zabránili šíření patogenu a zabránili epidemii,“ zdůrazňuje Elena Ufimtseva.
Vedoucí cesta
Žádná z diagnostických metod používaných v současnosti v klinických laboratořích protituberkulózního systému Ministerstva zdravotnictví Ruské federace není schopna v tak krátkém čase přinést podobné výsledky. Podle uznávané lékařské praxe je po plánovaných operacích část tkáně odebrané pacientovi odeslána na rozbor – histologický, bakteriologický a PCR.
Jejich úkolem je posoudit, zda se ve tkáních nachází mykobakteriální DNA a zda se v nich nevyskytly mutace, které způsobují rezistenci na antituberkulotika. A k určení virulence patogenu tuberkulózy jsou morčata infikována patogeny získanými z těla pacienta.
„Mnoho z těchto metod je velmi pracných, a co je nejdůležitější, na výsledky musíte obvykle čekat velmi dlouho – od jednoho do tří měsíců,“ říká Elena Ufimtseva. “A metoda, kterou jsme vyvinuli, nám umožňuje posoudit infekci mykobakteriemi hned první den po operaci.”
Klinika Uralského výzkumného ústavu Phthisiopulmonology také provádí všechny testy stanovené v protokolu schváleném Ministerstvem zdravotnictví Ruské federace. Elena Ufimtseva a Natalya Eremeeva již vyšetřily tkáň z plic 30 pacientů. Současně byly provedeny standardní studie stejných fragmentů. A pokaždé autoři nové techniky získali výsledky mnohem rychleji, než umožňují konvenční metody.
Nová technika překonává tradiční metody nejen rychlostí, ale i efektivitou. U jednoho z operovaných pacientů byly vyšetřeny plicní tkáně vzdálené od hlavních ložisek tuberkulózní infekce – dutin a tuberkulózy – na přítomnost mykobakterií.
Histologická analýza, která trvala týden, neodhalila v makrofázích v těchto oblastech vůbec žádné mykobakterie. Bakteriologický rozbor o dva měsíce později ukázal, že původce onemocnění v laboratorních podmínkách neroste a netvoří kolonie.
A výzkumníci ze Sibiře a Uralu během pouhých 18 hodin zjistili, že více než 3 % ochranných buněk v těchto plicních tkáních byla infikována a mykobakterie již vytvořily kolonie v téměř polovině těchto buněk. Existovaly další případy, kdy technika Eremeeva-Ufimtseva umožnila najít postižené buňky tam, kde je tradiční studie nenašly.
„Takto jsme se přesvědčili: v současnosti používané metody v klinických laboratořích nám neumožňují přesně posoudit ani infekci plicních buněk původcem onemocnění, ani funkční stav mykobakterií a samotných hostitelských buněk u operovaných plíce pacientů,“ shrnuje Elena Ufimtseva.
Zabíjet, ale neubližovat
Rychlost a efektivita zdaleka nejsou hlavními výhodami nové techniky. Jeho hlavní výhodou je, že umožňuje získat živé buňky infikované mykobakteriemi z plic pacientů s tuberkulózou.
Interakce mezi patogenem a hostitelskou buňkou je studována v umělém prostředí v době nejbližší jeho přítomnosti v těle pacienta. Proto jsou výsledky studia chování obranných buněk a mykobakterií, které je infikují, tak spolehlivé, jako by nadále zůstávaly v plicích pacientů.
„To znamená, že je možné provést personalizované posouzení situace, což není možné u žádné ze současně používaných diagnostických metod,“ vysvětluje Natalya Eremeeva. “Pokud se po dvou nebo třech dnech kultivace mimo tělo pacienta počet mykobakterií uvnitř makrofágů začne zvyšovat, můžeme dojít k závěru: proces tuberkulózy může postupovat.”
Přečtěte si také
“Splněný sen: hraju na syntezátor.” Proč lidé z celé země přijíždějí za doktory z Volgogradu?
Když předchozí léčba nepomohla zničit původce onemocnění, je nesmírně nutné upravit medikamentózní terapii. Koneckonců, pokud nezvolíte účinný lék, riziko relapsu po operaci se prudce zvýší.
„Uvnitř makrofágů jsou bakterie spolehlivě chráněny před vnějšími vlivy, takže ne každé antibiotikum je dokáže zničit. A nyní máme možnost testovat různé léky přímo v laboratoři a vyhodnocovat, zda jsou schopny si poradit právě s těmi kmeny mykobakterií, které u operovaného pacienta způsobily tuberkulózu,“ zdůrazňuje Natalya Eremeeva.
„Testovací metody běžně používaných léků proti TBC trvají mnoho měsíců. Hlavní ale je, že k jejich provedení je nutné v laboratorních podmínkách získat čisté izoláty mykobakterií z plicních tkání pacientů. Existuje však takzvaný „fenomén nekultivovatelnosti Mycobacterium tuberculosis“: izoláty lze získat pouze z plic několika pacientů. Tradiční metody jsou proto použitelné pouze u omezeného počtu pacientů. V naší metodě žádná taková omezení nejsou,“ dodává Elena Ufimtseva.
Přečtěte si také
“Železní muži” se znovu učí chodit
Najít správné antibiotikum pro daného pacienta je polovina úspěchu. Stejně důležité je zvolit dávku, která může zničit Kochovy bacily, ale zároveň způsobit minimální poškození těla pacienta, oslabeného po operaci.
Nová technologie vám to umožní za pár dní – najít optimální rovnováhu mezi účinností antituberkulotika a jeho toxicitou. Autoři metody již získali ruský patent na vynález „Metoda pro hodnocení antimykobakteriálního účinku antituberkulózních léků s využitím biologického materiálu od pacientů s plicní tuberkulózou“.
Existují metody, ale chybí politická vůle
Při vývoji výše popsané techniky učinily Elena Ufimtseva a Nadezhda Eremeeva další objev.
„Zkoumáním tkáně z plic různých pacientů jsme zjistili, že mykobakteria uvnitř makrofágů pravidelně tvoří takzvané provazce: seřazují se podél svých dlouhých os a splétají se do copů,“ vysvětluje Elena Ufimtseva. „Jako první na světě jsme objevili šňůrové kolonie mykobakterií v alveolárních makrofázích z plic pacientů s tuberkulózou. Dříve byl takový růst v provazcích někdy zaznamenán, ale pouze v laboratorních podmínkách, kdy se mykobakteriální kmeny množily na pevných živných půdách. Tento jev byl vysvětlen zvýšenou virulencí patogenu. Spojili jsme výskyt pupečníkových kolonií v makrofázích se zvýšenou virulencí mykobakterií infikujících plíce pacienta s tuberkulózou.“
Nová technika umožňuje detekovat kolonie šňůry za pouhých 16–18 hodin. Můžeme okamžitě vyvodit závěr: mykobakterie v plicích pacienta se vyznačují zvýšenou virulencí. A jak již bylo zmíněno, čím dříve se to podaří zjistit, tím snazší je zabránit šíření patogenu tuberkulózy a vyhnout se epidemii.
„Proto je tak důležité, abychom mohli provazce identifikovat hned druhý den po operaci. Dovolte mi připomenout, že analýza virulence u morčat bude trvat tři měsíce,“ zdůrazňuje Elena Ufimtseva.
Kochovy bacilové provazce jsou analogem bakteriálních biofilmů, které jsou nejodolnější vůči antibiotikům. I když používáte zvýšenou koncentraci léku, je v takových případech extrémně obtížné vyrovnat se s bakteriemi. Pokud jsou tedy pupečníkové kolonie odhaleny včas, umožní nám to vyvinout individuální léčebnou strategii pro pacienta po operaci. A další vývoj sibiřských a uralských vědců pomůže předcházet exacerbaci a relapsu onemocnění.
„Po analýze chování mykobakterií v plicních tkáních, které jsme studovali, jsme vyvinuli metodu pro hodnocení rizik reaktivace procesu tuberkulózy po operaci plic. Již jsme získali patent na vynález „Metoda pro stanovení schopnosti Mycobacterium tuberculosis reprodukovat se v alveolárních makrofázích pacientů, kteří podstoupili kúru antituberkulózní terapie,“ říká Elena Ufimtseva.
Autoři inovativního vývoje jsou přesvědčeni, že je lze rychle zavést do lékařské praxe klinik, kde se provádějí operace k odstranění tkání s ložisky tuberkulózní infekce z plic pacientů.
„Ještě jednou bych rád zdůraznil, že naše metody jsou snadno implementovatelné, informativní, vizuální a během několika dní vám umožní získat výsledky, které nejsou poskytovány standardními metodami, které se v současnosti používají na ruských klinikách a jsou financovány. státem. Mnoho klinických laboratoří již má potřebné vybavení pro buněčné kultury, světelné a fluorescenční mikroskopy. A spotřební materiál pro izolaci buněk z plicní tkáně stojí haléře. I když vezmeme v úvahu, že v Rusku se ročně provede přibližně 10 tisíc operací k odstranění plicní tkáně postižené tuberkulózou pacientům, stále to nebude příliš velké množství,“ říká Ufimtseva.
Přečtěte si také
Chlapec, který dostal příležitost promluvit
Pokud jde o bezprostřední plány, vědci budou pokračovat ve vědeckém výzkumu jejich témat. „V této práci se nám dostává neocenitelné pomoci od Centra pro kolektivní použití pro analýzu mikroskopických objektů Ústavu cytologie a genetiky, které vede Sergei Bayborodin. Domnívám se však, že je nutné začít cílevědomě zavádět naše metody do praxe,“ je přesvědčena Elena Ufimtseva.
Polina Vinogradová
© Tisková agentura TASS
Osvědčení o registraci média č. 03247 vydané 02. dubna 1999 Státním tiskovým výborem Ruské federace.
